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Outils et services

La plateforme IMPReSs fournit un panel de méthodes et d’outils optimisés pour la production, la purification et l’analyse de protéines membranaires.
Différents systèmes d’expression sont utilisés en routine au sein de la plateforme pour la production de protéines membranaires, mais également cytosolubles, en particulier le système levure Pichia pastoris et les systèmes bactériens Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Anabaena sp. PCC 7120.
Dans le but de s’adapter au mieux à vos besoins, IMPReSs propose des services modulables allant des étapes de clonage jusqu’à la purification de la protéine d’intérêt et sa caractérisation

 

1. Conseil sur les stratégies de production
Nous mettons notre expertise à votre service pour élaborer ensemble les meilleures stratégies de clonage, de production, de purification et d’analyse de la protéine d’intérêt en fonction de vos besoins et de vos contraintes.


2. Clonage
Le clonage du gène d’intérêt peut être pris en charge à partir d’ADN plasmidique ou d’ADNc confiés par le client, ou à partir d’un gène synthétique fourni par un prestataire. La plateforme dispose de différents vecteurs d’expression standards adaptés aux systèmes d’expression utilisés, qui peuvent être personnalisés en fonction de vos besoins (tags d’affinité, séquences de clivage …). Des approches classiques de clonage sont utilisées pour l’obtention des vecteurs recombinants.


3. Tests d’expression
Nous proposons une étude de faisabilité de production de la protéine d’intérêt dans le ou les systèmes d’expression disponibles les plus adaptés.
Dans le cas du système d’expression Pichia pastoris, l’utilisation de la technique de Yeastern Blot développée sur la plateforme permet un criblage simultané du niveau d’expression de 96 clones recombinants.


4. Production et préparation des échantillons protéiques
L’étape de production de la protéine d’intérêt peut être réalisées en flasques agitées jusqu’à un volume de 10 litres de milieu, selon vos besoins. Un scale-up en fermenteur de 3 litres est également possible sur demande.
Les protéines membranaires peuvent être fournies sous forme de préparations membranaires, obtenues par ultracentrifugation différentielle après lyse cellulaire. Nous proposons également un criblage des conditions d’extractions et de solubilisation des protéines membranaires pour un compromis optimal entre rendement d’extraction et qualité des protéines extraites.


5. Purification
La plateforme dispose de quatre chaînes de purifications automatisées (de type Äkta Purifier et Äkta FPLC), ainsi qu’un panel complet de colonnes et résines de chromatographies d’affinité, d’échange d’ions et d’exclusion de taille afin de s’adapter au mieux à chaque projet.
Selon vos besoins, une purification par des méthodes plus spécifique, comme le chromatofocusing, peut également être mise en place. Dans le cas de protéines membranaires, des criblages de détergents ou des échanges de détergents sont fréquemment réalisés.


6. Caractérisation
A chaque étape, différentes analyses biochimiques sont utilisées pour la caractérisation des échantillons protéiques (électrophorèse, immunodétection, chromatographie d’exclusion de taille). Des études de spectrométrie de masse peuvent également être envisagées.
Enfin, la plateforme propose une caractérisation avancée de l’activité de protéines plus spécifiques comme les récepteurs ou transporteurs membranaires, en utilisant des tests de liaison de radioligands ou des tests de transport.


7. Collection de RCPG recombinants
La plateforme IMPReSs possède une banque de levures Pichia pastoris exprimant près d’une centaine de récepteurs couplés aux protéines G fusionnés à différents tags d’affinité, permettant ainsi leur production et purification sur demande.

 

 

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